燕窝消化特性的体外实验（一）消化具有多种生物活性-语海云栈

燕窝为雨燕科金丝燕属鸟类分泌的燕窝验唾液与其羽绒混合凝结而成的物质，营养价值丰富，消化具有多种生物活性。特性燕窝主要营养成分为蛋白质、外实碳水化合物、燕窝验唾液酸，消化同时含有微量的特性脂质和无机元素。唾液酸是外实燕窝的核心物质，是燕窝验脑神经节苷脂的有益成分。燕窝的消化生物活性和其消化特性有关。研究发现，特性燕窝经过消化后抗氧化活性显著提高，外实能够保护细胞免受氧化损伤。燕窝验Ghassem等发现燕窝模拟消化产物中的消化多肽组分具有较高的抗氧化能力，分离纯化发现其中PFHPY和LLGDP两种肽能够保护HepG2细胞免受H₂0₂诱导的特性氧化损伤。Wong等研究发现，消化后的燕窝具有更强的美白活性和成骨活性，能够抑制酪氨酸酶的活性，减少小鼠黑色素瘤细胞巾的黑色素分泌量，同时促进成骨细胞增殖，增加小鼠的骨强度和真皮厚度。

唾液酸对酪氨酸酶活性具有剂量依赖性的抑制作用，对皮肤有美白功效。多肽和唾液酸是消化产物中的主要功能活性成分。目前关于燕窝的研究主要集中在原料的品质伪劣鉴定和生物活性评价，关于燕窝消化特性的研究没有详尽的报道。作者采用Standard法模拟炖煮燕窝体外胃肠的消化，对燕窝蛋白和碳水化合物的含量和组成进行了全面的测定分析，为进一步开发高胃肠消化特性的燕窝新产品提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

燕窝：市售；胃蛋白酶、胰蛋白酶：Sigma公司产品：鼠李糖，半乳糖，甘露糖，邻苯二胺盐酸盐，国药化学试剂有限公司产品：氨基葡萄糖、D-半乳糖胺盐酸盐、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸：上海创赛有限公司产品；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

傅立叶红外光谱仪：美国赛默飞世尔科技公司：PowerPac^TMBasicPowerSupply基础电泳仪电源：伯乐生命医学产品上海有限公司产品：摇摆式高速万能粉碎机：温岭市林大机械有限公司产品：DL-5-A低速台式大容量离心机、KDN-08C数显温控消化炉：上海新嘉电子有限公司产品：UV-2802紫外可见分光光度计：尤尼柯(上海)仪器有限公司产品：KDN-103F凯氏定氮仪：上海纤检仪器有限公司产品：高效液相色谱仪Waters2695(Waters2475荧光检测器、Waters2998紫外检测器)：美国Waters公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品预处理

燕窝研磨成粉末，用60目筛子过滤，收集过滤粉末，装袋，-20℃贮藏。

1.3.2 模拟体外消化过程

利用Standard法模拟胃肠消化：称量0.8g燕窝粉末，溶于10mL水中，沸水水浴1h，冷却至室温。将燕窝溶液与10mL的模拟胃液混合于50mL离心管内，37℃恒温振荡水浴，HCl调节pH使其始终保持在2.0±0.2，在100r/min的速度下模拟胃阶段消化，每个时间点单独做一个消化管，每隔30min依次用碱液调节pH至8.0灭酶，以4500g离心分离上清液，-20℃贮藏，分析0，30，60，90，120min的消化情况。胃消化结束后，进入小肠消化阶段。加入16mL模拟肠液，NaOH调节pH使其始终保持在7.0±0.2，补水使体系达到40mL。继续在100r/min的搅拌速度、37℃的温度下进行肠阶段体外消化，每个时间点单独做一个消化管，每隔30min将一个离心管进行沸水浴灭酶，4500g离心分离，上清液-20℃贮藏，离心沉淀物进行冻干储藏，分析150，180，210，240min的消化情况。

1.3.3 基本成分测定

蛋白质含量测定：参照国标GB5009.52016凯氏定氮法，蛋白质折算系数6.25，分别测定燕窝原料蛋白质含量和消化上清液中的水溶性蛋白质含量：总糖含量测定：参照国标GB/T15672—2009苯酚硫酸法，葡萄糖为标准品，分别测定燕窝原料总糖含量和消化上清液中的总糖含量。

1.3.4 水解度测定

参考杨文博等人的方法，采用甲醛滴定法。

水溶性蛋白质水解度(％)=p×V/m(1)

式中：P为消化上清液中游离氨基酸态氮质量浓度，g/mL：V为消化液体积，mL；m为消化上清液巾的燕窝蛋白总氮质量，g。

1.3.5 多肽测定方法

参考GB31645—2018胶原蛋白肽的测定。色谱条件：TSKgelG2000SWXL300min×7.8mm：柱温：30℃：流动相：乙腈：水：三氟乙酸，体积比为40:60:0.05。检测器：紫外检测器220nm；流量：0.5mL/min；进样体积10μL。

1.3.6 蛋白质二级结构测定方法

采用NicoletiS50FTIR型傅立叶变换红外光谱仪测定。扫描次数32次，入射角45°，扫描波数范围4000～600cm^-1，分辨率为4cm^-1。测试样品粉末衰减全反射红外光谱(ATR-FTIR)，每个样品重复采集3次。

1.3.7 唾液酸测定方法

参考袁玲和张肩伟等人的方法，采用领苯二胺(OPD)柱前衍生法测定燕窝原料和消化上清液的唾液酸含量。

取50mg原料溶解在40mL的体积分数1％磷酸溶液中，沸水浴水解20min，冷却后加入20mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1mL，80℃避光水浴40min，水系滤膜过滤，准备进样。

游离态唾液酸测定,取1mL液体样品，加入20mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1mL,50℃避光水浴2.5h，改变温度至4℃继续衍生48h，水系滤膜过滤，准备进样。

聚糖态唾液酸测定，取1mL液体样品，按体积比1:1加入Sevage试剂(V(三氯甲烷)：V(正丁醇)=4:1)反复萃取除去蛋白质，加入20mg/mL的邻苯二氨盐酸盐溶液1mL，80℃避光水浴40min，水系滤膜过滤，准备进样。

蛋白态唾液酸测定，取1mL消化上清液酸解，测定清液中唾液酸总量。

未溶解唾液酸测测定，取50mg燕窝消化后的离心沉淀物，溶解在40mL的1％体积分数磷酸溶液中，沸水浴水解20min，80℃避光水浴40min，水系滤膜过滤，准备进样。

1.3.8 单糖测定方法

参考戴军等人方法，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生高效液相色谱法测定燕窝原料和消化上清液的单糖组成。

1.3.9 蛋白质相对分子质量测定方法

取消化液与上样缓冲液等体积均匀混合，100℃加热3min变性处理，8000r/min离心3min。还原电泳条件：10g/dL分离胶，5g/dL浓缩胶，上样量10μL。对燕窝糖蛋白中的蛋白和糖链分别进行单独染色，考马斯亮蓝R-250进行蛋白染色，高碘酸-席夫碱法进行糖染色。ImageLab图像软件用于SDS-PAGE凝胶分析。